ASTM F2944-20
自動コロニー形成ユニット (CFU) 分析の標準的な手法 培養中の細胞とコロニーを計数および特性評価するための画像取得および分析方法

規格番号

ASTM F2944-20

制定年

2020

出版団体

American Society for Testing and Materials (ASTM)

最新版

ASTM F2944-20

範囲

1.1 この実践では、その限界が理解されている限り、画像解析を使用して幹細胞または前駆細胞集団に由来するコロニーの数と生物学的特性を定量的に測定する手順について説明します。 1.2 この実践は、in vitro の実験室設定に適用されます。 1.3 この実践では、(a) 定義された視野 (FOV) での定義された出発細胞集団の in vitro 処理から得られた細胞およびコロニーの画像キャプチャのための標準化されたプロトコル、および (b) 画像処理および分析のための標準化されたプロトコルを利用します。 。 1.4 関連する FOV は、調査対象の CFU アッセイ システムに応じて、2 次元または 3 次元の場合があります。 1.5 分析結果に使用される主な単位は、FOV 内に存在するコロニーの数です。 さらに、FOV 内の個々のコロニーおよび細胞の特性および下位分類も、既存の形態学的特徴、分布特性、または二次マーカー (たとえば、染色または標識法) を使用して引き出された特性に基づいて評価することもできます。 1.6 画像化方法では、個々の細胞の検出と特性評価を可能にするのに十分な解像度で、コロニーを完全な評価対象として検出、区別、特性評価するのに十分な FOV にわたって、関連する FOV の画像を取得する必要があります。 1.7 2 次元および 3 次元のデータセットに適用できる画像処理手順は、FOV 内の目立たないオブジェクトとして細胞またはコロニーを識別するために使用されます。 イメージング方法は、共有系統関係 (つまり、細胞のクローン拡大) を示す方法で、近接性または形態によって相互に関連する細胞のグループを定義するセグメンテーションおよびクラスタリング用の分析ツールを使用して、複数の細胞タイプおよび細胞の特徴に合わせて最適化できます。 単一の創始幹細胞または前駆細胞）。 1.8 個々のコロニーオブジェクトの特性 (コロニーあたりの細胞数、細胞密度、細胞サイズ、細胞分布、細胞の不均一性、細胞の遺伝子型または表現型、および二次マーカーの発現のパターン、分布および強度) は、基礎となる生物学的特性の違いについての情報となります。 クローン子孫の。 1.9 適切に制御された実験条件下では、コロニー間の差異は、開始集団内のコロニー形成細胞 (CFU) の生物学的特性および根底にある不均一性についての情報となる可能性があります。 1.10 細胞およびコロニーの面積/体積、数などは、細胞培養面積 (平方ミリメートル) または初期細胞懸濁液の体積 (ミリリットル) の関数として表すことができます。 1.11 2 つ以上の光学的方法を使用した FOV の連続イメージングは、サンプル内の個々の細胞またはコロニーオブジェクトに関する定量的情報を蓄積するのに有益である可能性があります。 さらに、プロセスの追跡と検証の設定では、同じサンプルの繰り返しイメージングが必要になります。 したがって、この実践には、定義された座標系を使用して FOV エリア/ボリューム内の細胞およびコロニー (重心) の位置を再現可能に識別する手段が必要です。 1.12 十分に大きな視野 (FOV) を達成するには、十分な解像度の画像を高倍率で複数の画像フィールド/タイルとして取得し、それらを組み合わせて細胞培養領域全体を表すモザイクを形成します。 1.13 組織工学、再生医療、および細胞療法で一般的に使用される細胞および組織は、元の幹細胞および前駆細胞集団の数、有病率、生物学的特徴、および生物学的可能性を定義するために日常的にアッセイおよび分析されます。 1.13.1 一般的に適用可能な細胞タイプおよび細胞源には、以下が含まれますが、これらに限定されません。 哺乳動物の幹細胞および前駆細胞。 成人由来細胞 (血液、骨髄、皮膚、脂肪、筋肉、粘膜など) 細胞、胎児由来細胞 (1 個あたり) この業務は、医療および外科用材料および機器に関する ASTM 委員会 F04 の管轄下にあり、 TEMP 用の細胞および組織工学的構築物に関する小委員会 F04.43 の直接責任。 現行版は 2020 年 4 月 1 日に承認。 2020 年 6 月発行。 初版は 2012 年に承認。 前回の前版は 2012 年に F2944–12 として承認。 DOI: 10.1520/F2944– 20. Copyright © ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, PO Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959. 米国 この国際規格は、国際開発原則に関する決定で確立された標準化に関する国際的に認められた原則に従って開発されました。 世界貿易機関貿易技術障壁 (TBT) 委員会によって発行された基準、ガイド、推奨事項 (例: 臍帯血、胎盤/臍帯、羊水)。 胚性幹細胞（ESC）（つまり、胚盤胞の内部細胞塊に由来する）。 人工多能性細胞 (iPC) (例えば、再プログラムされた成体細胞);増殖した細胞を培養する。 特定の種類の組織の最終分化細胞。 1.13.2 クローンコロニー内およびクローンコロニー間の分化の検出に関連する成熟分化表現型の一般的な適用例には、造血表現型 (赤血球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージなど)、成体組織特異的表現型が含まれます。 前駆細胞の表現型 (骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など)、およびその他の組織 (肝細胞、ニューロン、内皮細胞、ケラチノサイト、膵島など)。 1.14 さまざまな組織内の幹細胞および前駆細胞の数は、基礎となる幹細胞および/または前駆細胞集団の生存能力および生物学的潜在能力を保存する方法を使用して組織から細胞を遊離し、組織由来の細胞を配置することによって、in vitro でアッセイできます。 インビトロ環境における細胞のクローンコロニーとしての幹細胞と前駆細胞の効率的な活性化と増殖をもたらします。 これにより、幹細胞と前駆細胞の真の数 (真のコロニー形成単位 (tCFU)) は、形成されたと観察されたコロニー形成単位 (観察されたコロニー形成単位 (oCFU)) の数に基づいて推定できます (1-3)。 2 (図A1.1)。 幹細胞および/または前駆細胞の蔓延は、検出された観察されたコロニー形成単位 (oCFU) の数をアッセイされた総細胞数で割ったことに基づいて推定できます。 1.15 細胞およびコロニーの計数に対する自動画像取得および分析アプローチ (本明細書に記載) は検証されており、観察者が手動で定義する明視野下での目視による細胞およびコロニーの計数という現在の「ゴールドスタンダード」と比較した場合、優れた精度と精度を提供することがわかっています。 血球計数器の有無にかかわらず蛍光顕微鏡 (4) により、観察者内および観察者間の両方の変動が軽減されます。 過去にいくつかのグループがこのプロセスや同様のプロセスを自動化しようと試みてきました (5、6)。 最近の報告では、さまざまな細胞型のコロニーの定性的および定量的データを細胞レベル、さらには核レベルで抽出できることがさらに実証されています (4、7)。 1.16 ソフトウェアとハードウェアの進歩により、体系的な自動分析アプローチが広く可能になりました。 この進化するテクノロジーにより、この実践で示されているように、測定単位、命名法、プロセス定義、および分析的解釈に関する一般的な合意が必要になります。 1.17 自動 CFU 分析の標準化された方法は、いくつかの科学的および商業的領域における CFU アッセイの価値と有用性を高める機会を開きます。 1.17.1 自動 CFU 分析の標準化された方法は、一般化可能なプロトコルと最適化を通じて CFU 分析法の特異性を向上させる機会を開きます。 特定の細胞タイプと CFU アッセイシステムの定量的メトリクスを、異なる研究室間で均一に適用できます。 1.17.2 自動 CFU 分析の標準化された方法により、スループットが向上し、ワークフローの要求が軽減されるため、生物科学のあらゆる側面でコロニー分析のコストを削減する機会が生まれます。 1.17.3 自動 CFU 分析の標準化された方法は、付着、移動、増殖、分化、および生体外条件、生物学的刺激、生体材料、および生体外処理ステップの影響を検出しようとする実験システムの感度と特異性を向上させる機会を開きます。 幹細胞と前駆細胞の生存。 1.18 制限は次のように説明されます。 1.18.1 コロニーの同定 - 細胞源/コロニーの種類/マーカーの変動性 - さまざまな組織源からの、異なる in vitro 環境にある幹細胞および前駆細胞は、異なる生物学的特徴を示します。 したがって、細胞または核を検出するための具体的な手段と利用される二次マーカー、およびそれぞれの染色プロトコルの実行は、CFU アッセイシステム、細胞の種類、および調べられるマーカーによって異なります。 細胞とコロニーを検出し、コロニーオブジェクトを定義し、コロニーオブジェクトを特徴付けるための画像キャプチャと画像分析の最適化されたプロトコルは、使用する細胞ソースと使用する CFU システムによって異なります。 これらのプロトコルは、アプリケーションごとに独立した最適化、特性評価、検証を必要とします。 ただし、一度定義すると、これらは研究室間、臨床および研究領域全体で一般化できます。 1.18.2 画像取得における機器誘発の変動 - 上述の画像取得コンポーネントの選択は、適切に対処しない場合、細胞のセグメンテーションおよびその後のコロニーの同定に悪影響を与える可能性があります。 たとえば、光ファイバー蛍光光源ではなく水銀電球を使用したり、光学系の一般的な位置ずれにより、一次の大きな FOV 画像を構成するタイル画像に不均一な照明や口径食が発生する可能性があります。 これは、タイルをスティッチングする前に、大きな FOV 画像内の各タイルに背景減算ルーチンを適用することで修正できます。 1.18.3 CFU アッセイ システムに関連する画像アーチファクトの変動 - コロニー識別を定義するために利用する必要がある固有の特徴を持つコロニー オブジェクトの表示に加えて、各 CFU システムからの各画像には、非細胞および非コロニー アーチファクトが表示される場合があります（たとえば、細胞の破片、糸くず、ガラスの異常、反射、自家蛍光など)、これらを特定して管理しないと、細胞やコロニーの検出が混乱する可能性があります。 1.18.4 画像キャプチャ方法と品質管理の変動 - 画質の変動は、画像解析方法の精度と再現性に大きく影響します。 焦点、照明、タイルの位置合わせ、露光時間、消光、発光スペクトルのにじみの変動はすべて、画質と再現性に対する重要な潜在的な制限または脅威です。 2 括弧内の太字の数字は、この規格の最後にある参考文献のリストを参照しています。 F2944 − 20 2 1.19 SI 単位で記載されている値は標準値とみなされます。 この規格には他の測定単位は含まれません。 1.20 この規格は、その使用に関連する安全上の懸念がある場合、そのすべてに対処することを目的とするものではありません。 適切な安全衛生慣行を確立し、使用前に規制上の制限の適用可能性を判断することは、この規格のユーザーの責任です。 1.21 この国際規格は、世界貿易機関貿易技術障壁 (TBT) 委員会によって発行された国際標準、ガイドおよび推奨の開発のための原則に関する決定で確立された標準化に関する国際的に認められた原則に従って開発されました。

ASTM F2944-20 規範的参照

• ASTM F2998 蛍光顕微鏡を使用して固定細胞の広がり領域を定量化するためのガイドライン*， 2024-04-10 更新するには
• ASTM F3294 広視野蛍光顕微鏡を使用した細胞分析における定量的蛍光強度測定の標準ガイド
• ISO 20391-1 バイオテクノロジー、細胞計数、パート 1: 細胞計数方法に関する一般的なガイダンス。
• ISO 20391-2 バイオテクノロジー - 細胞計数 - パート 2: 計数方法のパフォーマンスを定量化するための実験計画と統計分析

ASTM F2944-20 発売履歴

• 2020 ASTM F2944-20 自動コロニー形成ユニット (CFU) 分析の標準的な手法 培養中の細胞とコロニーを計数および特性評価するための画像取得および分析方法
• 2012 ASTM F2944-12 自動コロニー形成ユニット (CFU) アッセイの標準試験法 培養細胞およびコロニーの計数および特性評価のための画像取得および分析法