T/GDBK 007-2023
マイクロプレートリーダー法（蛍光プローブ法）を用いた焼き菓子中のアクロレインの迅速測定 (英語版)

規格番号

T/GDBK 007-2023

言語

中国語版, 英語で利用可能

制定年

2023

出版団体

Group Standards of the People's Republic of China

最新版

T/GDBK 007-2023

範囲

原理 N-酢酸メチル-4-メルカプト-1,8-ナフタルイミドのチオール基はナフタルイミドの蛍光コアに対して PET 効果を持ち、それ自体の蛍光は非常に弱いため、アクロレインの存在下では N のメルカプト基が-酢酸メチル-4-メルカプト-1,8-ナフタルイミドとアクロレインはマイケル付加反応により付加物を形成し、PET効果を抑制します この付加物は励起波長380nmで発光し、ピークを有する強い蛍光を発します波長510nmの蛍光強度は、一定条件下で被検サンプル中のアクロレイン濃度に比例し、蛍光検出器付きマイクロプレートリーダーで検出し、外部標準法により定量します。 蛍光プローブ法によるアクロレインの定量原理を図1に示します。 図 1 蛍光プローブ法によるアクロレインの定量原理 5 試薬および材料 5.1 試薬 特に指定のない限り、すべての試薬は分析グレードであり、水は GB/T 6682 に規定されている一級水です。 4-ブロモ-1,8-ナフタレンジカルボン酸無水物（分析グレード）。 グリシン (分析的に純粋)。 トリエチルアミン (分析グレード)。 エタノール（分析グレード）。 塩酸（分析グレード）。 p-トルエンスルホン酸（分析グレード）。 メタノール（分析グレード）。 硫化ナトリウム九水和物（分析的に純粋）。 ジメチルスルホキシド (DMSO、分析グレード)。 クエン酸（分析グレード）。 リン酸水素二ナトリウム (分析的に純粋)。 アクロレイン（分析グレード）。 5.2 蛍光プローブの調製: 4-ブロモ-1,8-ナフタレンジカルボン酸無水物 554 mg、グリシン 165 mg、トリエチルアミン 252 mg をエタノール中、80℃で 6 時間還流磁気撹拌しながら反応させた。 室温に戻し、反応液に 1M 塩酸水 2.5 mL を加え、白色沈殿が析出するまで pH を調整し、吸引ろ過して得られた固体を水 10 mL、エタノールでそれぞれ洗浄し、得られた白色固体が N-アセトキシである-4-ブロモ-1,8-ナフタルイミド; 167 mg の N-アセトキシ-4-ブロモ-1,8-ナフタルイミドと 600 mg の九水和物を室温で硬化させた。 ナトリウムを 5 mL N,N-ジメチルホルムアミドに溶解する反応後、反応液を水 20mL に注ぎ、1M 塩酸水溶液で pH 2 に調整すると、黄色の沈殿が析出します。 吸引ろ過により得られた固体を水で５回洗浄した後、得られた黄色固体をＮ－アセトキシ－４－メルカプト－１，８－ナフタルイミド（Ｐｒ－ＡＣＲ）とし、凍結乾燥し、－２０℃で保存した。 冷蔵庫。 5.3 pH 2.2、1 mmol/L のクエン酸-リン酸水素二ナトリウム緩衝液の試薬の調製 クエン酸一水和物 15.198 g およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物 1.955 g を水に溶解し、250 mL メスフラスコの容量を希釈します。 。 プローブ母液: 2.15 mg Pr-ACR を 0.5 mL DMSO に溶解し、濃度 150 mmol/L のプローブ母液を作成します。 母液は調製してすぐに使用する必要があります。 プローブ作業溶液: 50 L Pr-ACR 母液を 5 mL メスフラスコにピペットで移し、4.3.1 の緩衝液で容量を 5 mL に調整します。 作業溶液は調製してすぐに使用する必要があります。 5.4 標準アクロレイン標準 (C3H4O、CAS 番号: 107-02-8): 純度 98.0% 以上。 5.5 標準液の調製: アクロレイン濃度 30μmol/L の溶液を水で調製し、水で希釈して混合し、濃度 (0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol) の一連の標準液を取得します。 /L、18μmol/L、24μmol/L、30μmol/L）。 6 機器および装置 6.1 マイクロプレートリーダー (蛍光検出器付き、Ex 250-600 nm、Em 280-600 nm)。 6.2 96 ウェル プレート (黒)。 6.3 粉砕機（細かさ：30～100メッシュ）。 6.4 バランス: 感度 0.00001 g. 6.5 ピペット (1 μL-10 L、10 L～100 L、および 100 L～1000 L)。 6.6 一般的なガラス製品。 6.7 遠心分離機（12000 rpm、14000×g）。 7 試験手順 7.1 検量線の作成 4.3.3 のプローブ作動液 100μL を 96 ウェルプレートにピペットで取り、4.5 で濃度の異なるアクロレイン標準液 50μL を加え、それぞれアクロレイン濃度を調製します。 ;μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、よく振って25 に置く℃で90分間放置後、蛍光検出用マイクロプレートリーダーにセットし、波長510 nm（励起波長は380 nm）での蛍光強度値を読み取ります（蛍光発光スペクトルは付録Aを参照）。 7.2 サンプルの準備 1 g 粉砕した食品粉末を 15 mL の遠心分離管に加え、5 mL の水を加え、均一に撹拌して 20 min の超音波抽出を行った後、10 r/min で遠心分離機を使用します。 回転速度で 20 分間回転させ、上清を回収します。 上記操作を 2 回繰り返し、遠心管内の沈殿物を水 2 mL で 2 回抽出し、3 回の抽出で得られた上清を合わせて 10 mL にメスアップします。 7.3 サンプルの測定：4.3.3 のプローブワーキング溶液 100μL を黒色の 96 ウェルプレートに移し、6.2 のサンプル抽出溶液 50μL を加えてよく振り、25℃に置き 90℃反応させます。 1分後、マイクロプレートリーダーで蛍光検出を行い、波長510nm（励起波長380nm）での蛍光強度値を読み取り、各処理を3回繰り返す。 7.4 空実験は、サンプルの重量を量らないことを除き、上記の測定条件および手順に従って実行するものとします。 8 試験データの処理 サンプル中のアクロレイン含有量は、次の式に従って計算されます: 含有量、ミリグラム/kg (mg/kg); 56.06  　—— アクロレインのモル質量; C  　—— モル質量濃度サンプル溶液中のアクロレインの量、マイクロモル/L (μmol/L) ; V  　—— 試験するサンプルの総量、ミリリットル (mL); m  　—— 試験するサンプルの質量重さを量る、グラム(g)。 計算結果は、再現性条件下で得られた 3 つの独立した測定結果の算術平均として表され、結果には 3 つの有効数字が保持されます。 9 精度 9.1 一般規定 この文書の精度は GB/T6379.2 の規定に従って決定され、再現性および再現性の値は 95% の信頼水準で計算されています。 9.2 再現性 再現性の条件下では、得られた 2 つの独立した測定結果間の絶対差は算術平均の  10%  を超えてはなりません。 9.3 再現性 再現性条件下では、得られた 2 つの独立した測定結果間の絶対差が算術平均の  10%  を超えてはなりません。 10 試験報告書 試験報告書には、少なくとも次の側面が記載されている必要があります: 　——試験対象; 　——使用した規格; 　——使用した方法; 　——結果; 　——観察された異常現象; 　——試験日。 付録 A (参考) 蛍光発光スペクトル チャート

T/GDBK 007-2023 発売履歴

• 2023 T/GDBK 007-2023 マイクロプレートリーダー法（蛍光プローブ法）を用いた焼き菓子中のアクロレインの迅速測定