T/SDAA 0045-2021
パスツレラ・ムルトシダの検出のためのPCR法 (英語版)

規格番号

T/SDAA 0045-2021

言語

中国語版, 英語で利用可能

制定年

2021

出版団体

Group Standards of the People's Republic of China

最新版

T/SDAA 0045-2021

範囲

パスツレラ ムルトシダの PCR 法による検出 1 適用範囲 この文書は、豚におけるパスツレラ ムルトシダの PCR 検出法を規定する。  この方法は、豚におけるパスツレラ・ムルトシダの検出に適しています。  2 規範参照文書 以下の文書の内容は、本文中の規範参照を通じてこの文書の重要な規定を構成します。 このうち、日付のある参照文書については、その日付に対応するバージョンのみがこの文書に適用され、日付のない参照文書については、最新バージョン (すべての修正を含む) がこの文書に適用されます。  NY/T 遺伝子配列に基づいて一対の特異的なプライマーを設計し、パスツレラ ムルトシダの DNA 核酸を鋳型として使用して、特異的な標的 DNA 断片を増幅します。 増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動し、DNAバンドの大きさで判定します。  4 試薬または材料 特に指定がない限り、使用されるすべての試薬は分析グレードのものです。  4.1 水: GB/T6682、レベル 1。 5% 羊血液プレート ;4.7 TAE バッファー 4.8 4S Green Plus 非毒性核酸色素 T/SDAA 0045-2021 5 機器および装置 5.1 生物学的安全キャビネット: 装備ULPA製超高性能エアフィルター。  5.2 高速冷凍遠心機:回転速度は 12000 /min 以上です。  5.3 PCR 装置: 最大加熱および冷却速度は 4℃/秒、温度範囲は 4℃〜99℃です。  5.4 ゲル イメージャー: 画像解像度は 500 万ピクセル以上で、感度は 20pg 未満の EB 染色二本鎖 DNA を検出できます。  5.5 紫外線透過率メーター:透過紫外線光源の波長は 302nmです。  5.6 電気泳動装置、定電圧出力範囲: 3~300V、定電流出力範囲: 1~400mA、定電力出力範囲: 1~ 120W。  6 サンプル NY/T 541 の規定に従ってサンプルを収集および保管します。   7  種。 採取した肺、肝臓、脾臓の場合は、アルコール ランプを備えた赤熱した刃を使用して肺、肝臓、脾臓の表面を焼灼し、滅菌済みの外科用ハサミを使用して焼灼部位に小さな開口部を切ります。 接種ループをアルコールランプの炎で焼き、冷却後病原体の小さな開口部から肺などの内部に挿入し、少量の組織を採取し、5%の割合で縞状に接種します。 羊の血のプレート。 接種後、プレートにラベルを貼り恒温槽に置き、37℃で24時間インキュベートし、コロニーの大きさ、形態、溶血などを観察します。  7.1.2 パスツレラ ムルトシダのコロニーは丸く、端が整っていて、表面は滑らかな粘液状で、サイズは約  1mm～1.5mm コロニーの形態については、付録 A.1 を参照してください。 。 7.2 グラム染色と顕微鏡検査  水膜。 単一のコロニーを選択し、水膜に均一に塗布し、室温で乾燥させ、炎で固定します。 グラム染色を行います。   7.2.2 、乾燥 ; 、1 分間対比染色し、流水でゆっくりとすすぎ、自然乾燥させます。  7.2.6 顕微鏡検査 ブタのパスツレラ・ムルトシダは、グラム陰性の短桿菌または球桿菌です。 細菌の形態については、付録 A.2 を参照してください。 7.3 PCR 検出 7.3.2 PCR 増幅 7.3.2.1 プライマー パスツレラ・ムルトシダ 16S rRNA 遺伝子配列（付録 A.3を参照）に基づいて一対のプライマーを設計し、市販合成、プライマー配列は付録 B.1 に示されています。  7.3.2.2 PCR 反応システム PCR 反応システムは 25μL システムです。 付録 B.2を参照してください。  7.3.2.3 PCR 反応条件 サンプル反応チューブを 2000 rpm/min 1minで遠心分離し、増幅のために PCR アンプに入れました。 PCR 反応条件は次のとおりです:94℃ 変性前 5 分、94℃ 変性 30 秒、53℃ アニーリング 30 秒、72℃ 伸長 30 秒、増幅 32 サイクル、72℃ 最終伸長は反応が終わるまで10分。 同時に、パスツレラ・ムルトシダの陽性（標準株）および陰性（滅菌水）対照を設定した。 PCR増幅産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動し、増幅されたDNAバンドのサイズをUVトランスイルミネーターまたはゲルイメージャーで観察します。 7.4 PCR 産物のアガロースゲル電気泳動は、NY/T 564-2016 4.4.6 に従って実行されます。  7.5 結果の判定 7.5.1 テストを確立するための条件 DL2000 DNA Markerの DNA バンドのサイズを参照 ポジティブコントロールが約 355bp のフラグメントを増幅する場合、ネガティブコントロールではフラグメントは増幅されず、試験結果は確立されました。 核酸電気泳動の結果は付録 B.3 に示されています。  7.5.2 陽性判定 7.5.1 の条件下で、検査サンプルが約  355bp  のフラグメントを増幅した場合、検査された細菌はパスツレラ・ムルトシダであると判定されます。 T/SDAA 0045-2021 7.4.5.3 陰性判定 7.5.1 の条件に準拠 検査サンプルが約 355bp の断片を増幅しない場合、検査した細菌は過剰ではないと判断されますパスツレラ菌を殺菌します。

T/SDAA 0045-2021 発売履歴

• 2021 T/SDAA 0045-2021 パスツレラ・ムルトシダの検出のためのPCR法