T/CSBM 0022-2022
分解性マグネシウムベースの金属骨インプラント部位における分解、骨形成および組織反応の評価方法 (英語版)

規格番号

T/CSBM 0022-2022

言語

中国語版, 英語で利用可能

制定年

2022

出版団体

Group Standards of the People's Republic of China

最新版

T/CSBM 0022-2022

範囲

1  実験計画 1.1  概要 この方法は、医療分解性マグネシウムベースの金属骨インプラントを試験動物の骨組織に一定期間移植し、その後、異なる時点でのイメージングと組織を使用します。 定量的画像分析と組み合わせた科学的検査を使用して、分解性マグネシウムベースの金属骨インプラントの移植後の分解性能、骨形成能力、および局所組織反応を評価しました。 注: in vivo 分解試験を実施する前に、GB/T 16886.15 の要件に従ってインプラントの定性および定量分析を実施することをお勧めします。 1.2 サンプルの準備 1.2.1 試験サンプル 1.2.1.1 試験サンプルの物理的特性 (形状、表面粗さなど) は、材料の分解性能に影響を与える可能性があります。 1.2.1.2  各試験サンプルは、最終製品と同じ製造、取り扱い、洗浄、滅菌および梱包プロセスを受けるものとします。 1.2.1.3 サンプルの調製と滅菌後は、移植前または移植中に傷、損傷、または汚染が生じないよう特別な注意を払う必要があります。 1.2.2  参照サンプルについては、すでに市場に出回っており、現時点では分解性マグネシウムベースの金属の比較に適しているとは認識されていない材料、または候補の分解性マグネシウムベースの使用目的と一致する材料を選択することを検討してください。 金属であり、臨床的に証明されている。 移植後の局所組織学的反応の程度を評価し、材料の分解速度と新骨形成速度を比較するために、同様の材料が受け入れられた。 1.2.3 サンプル形状 移植されたサンプルは、円筒形状、ネジ形状、またはネジ山を刻んだ形状に加工できます。 1.2.4 サンプルサイズ 移植されるサンプルのサイズは、選択した動物とその骨組織のサイズに基づいて決定されます。 注：原則として GB/T 16886.6-2015 の規定を参照し、直径 2mm、高さ 6mm のシリンダーを使用してウサギの脛骨または大腿骨に移植することを推奨します。 1.3 実験動物と移植部位 1.3.1 実験動物 1.3.1.1 実験動物は、GB/T16886.2 および実験動物に関する国家規制に従って選択および飼育されるべきであり、実験動物は餌と水を自由に摂取できる必要があります。 1.3.1.2  骨内移植試験には時間がかかります。 通常は体重 2.5kg 以上のニュージーランド産ウサギが好まれます。 雌ウサギは不妊である必要があります。 1.3.1.3 各検査（脱灰および非脱灰）の各試験サイクルで少なくとも 10 個の試験サンプルと 10 個の参照サンプルが確実に得られるように、十分な数の動物を選択する必要があります。 1.3.2  移植部位 1.3.2.1  移植部位としてウサギの脛骨または大腿骨を選択するには、GB/T 16886.6-2015 を参照することをお勧めします。 模擬臨床使用部位またはその他の適切な部位ということも考えられます。 注: 模擬臨床使用施設またはその他の適切な施設は、7.1.2 の分析要件を満たしている必要があります。 1.3.2.2  試験サンプルと参照サンプル（存在する場合）は、同じ条件下で同じ動物の両側の同じ解剖学的部位に移植する必要があります。 移植部位を選択する際には、移植手術によって試験部位に病的骨折が生じないことを確認する必要があり、若い動物の場合、骨端領域やその他の未熟な骨への移植は避けるべきです。 1.4  試験期間 1.4.1  試験期間は、試験サンプルの使用目的と分解性能に基づいて決定する必要があります。 in vivo 動物実験を行う前に、試験サンプルの分解時間を事前に評価する必要があり、その分解時間は、in vitro 分解試験または特定の環境下での数理モデルを通じて計算できます。 原則として、テストサイクルは少なくとも（ただしこれに限定されない）3 つの観察期間に設定する必要があります。 これは通常、テストサンプルの分解と吸収の時間より長くする必要があります。 または、テストサイクルは対応する時間を許容できる必要があります。 安定状態に達するための組織反応。 通常、少なくとも (ただしこれらに限定されない)、次の 3 つの時点を設定する必要があります: a) 劣化がないか、またはごく少量のみ; b) 劣化プロセスでは、残留量が減少した時点を含めることをお勧めします。 インプラントの残存率は約 50%; c) 組織の反応は安定した状態にあるか、インプラントがほぼ完全に劣化しています。 1.4.2  インプラントの分解速度と周囲の組織構造の変化は時間の経過とともに変化します。 12 週間以内にほぼ完全に分解すると予想される材料の場合は、観察期間として 1 週間、4 週間、12 週間を選択することをお勧めします。 1.4.3  12 週間で完全に分解するか、定常分解状態に達すると予想される材料の場合は、上記の原則を参照し、インプラントの分解特性に基づいてテスト期間を選択できます。 2  試験方法 2.1  手術プロセス 2.1.1  麻酔および無菌条件下で、従来の外科的要件に従って以下の外科プロセスを実行します。 a) 外側大腿骨または内側脛骨の皮膚を準備し、消毒し、ドレープ; b) 皮膚を切り、皮下組織を分離し、筋肉の隙間に沿って骨皮質を露出させます; c) 生理食塩水で洗い流しながら冷却しながら、低速で断続的に穴を開けます。 脛骨または大腿骨の場合、片側に 2 つの穴、最大 3 つの穴を開け、深さはインプラントの長さに近く、穴の直径は 2 mm、2 つの穴の間の距離は 10 mm 以上です。 )  骨の破片を除去します; e) サンプルの表面が平らになるか、骨皮質の表面よりわずかに低くなるように、サンプルを優しく押してインプラントし、ネジ付きインプラントを穴にねじ込みます; f )  筋肉、筋膜、皮膚を層ごとに縫合します。 2.1.2  参照サンプルは対側と同じ方法で操作されます。 2.2  術後の臨床観察 2.2.1  移植後 2 週間以内は、出血、発赤、腫れ、気腫、インプラントの分泌物などの異常がないか、移植部位の皮膚反応を毎日観察する必要があります。 。 2.2.2  試験期間中定期的に動物の健康状態を観察し、局所反応や異常行動などの異常所見を記録する。 2.2.3  死亡した動物の数を記録し、適時に剖検を実施します。 瀕死の動物は隔離され、適時に殺されます。 2.3  動物の屠殺: 観察期間の終了時に、動物は麻酔薬の過剰摂取により痛みを伴わずに安楽死させられます。 2.4  肉眼的観察 2.4.1  インプラント部位の組織を目視または低倍率拡大鏡で観察し、血腫、浮腫、線維性被包、および/または肉眼的な所見。 表面形態、位置、完全性、残存状態など、インプラントの観察可能な状態を記録します。 2.4.2  移植部位を観察する際、動物が病気であるか、インプラントに対して異常な反応を示す場合は、必要に応じて肉眼解剖を行う必要があります。 2.5 材料収集と病理組織切片の準備 2.5.1 基本要件 2.5.1.1 除去される組織標本には、インプラントとその周囲の十分な影響を受けていない組織が含まれている必要があります。 2.5.1.2  除去した組織ブロックを固定し、脱灰と非脱灰の 2 つの調製技術を使用して病理組織切片を調製し、移植後の局所的な組織学的反応、および材料と新骨の分解を評価しました。 生成状況です。 2.5.2 日常的な病理組織切片の作製（脱灰） インプラントを含む骨組織ブロックは、2 週間固定した後、直ちに 10% ホルムアルデヒド溶液およびその他の適切な固定方法に浸し、その後、適切な脱灰装置に設置する必要があります。 病理学的切片はインプラントの長軸に対して垂直に作成され、HE 染色が行われました。 注: EDTA などの脱灰溶液。 2.5.3 硬組織病理学的切片の調製（脱灰なし） 2.5.3.1  インプラントを含む骨組織ブロックは、採取後直ちに 70% アルコールで 1 ～ 2 週間固定し、その後勾配で脱水する必要があります。 キシレンで透明にし、メタクリル酸メチル溶液で１週間浸透させ、ポリメタクリル酸メチルで包埋した。 硬化後、硬組織ミクロトームを使用して、皮質骨線維領域内のインプラントの長軸に対して垂直に切片を切断した。 50μm±10μmの厚さに研削・研磨し、最後にVG酸フクシンなどで染色する。 2.5.3.2  同時に、移植されていない試験サンプルを採取し、ポリメチルメタクリレートで包埋し、硬化後、硬組織ミクロトームを使用して試験サンプルの長軸に対して垂直にスライスし、研削および研磨して、の厚さは50μm±10μmで、埋入前のインプラントの総断面積を計算するために使用されます。 注: 組織切片を作成するときは、各移植ポイントで皮質骨領域を切り取ります。 2.6  必要に応じて、マイクロ CT 画像検査を使用して金属インプラントの 3 次元劣化を分析できます。 装置の条件に応じて、適切な電圧、電流、露光時間を選択し、有効ピクセル サイズを選択する必要があります。 10μmで。 対応するソフトウェアを使用して、劣化した残留金属と新しく形成された骨の体積を計算します。 3  結果の評価 3.1  分解および骨形成性能 3.1.1 定性分析では、非脱灰硬組織切片を使用し、インプラントが分解し、移植部位で新しい骨が形成されているかどうかを光学顕微鏡で観察します。 織物骨、層状骨、骨髄などの新しい骨の成熟度を観察して説明します。 3.1.2 定量分析 3.1.2.1 インプラントの残存量と新生骨形成量の分析 3.1.2.1.1  光学顕微鏡を使用して各試験サンプルのスライスの画像を収集し、注入を計算するための画像解析システム 注入前の総断面積。 注: 分析には ImageJ ソフトウェアを使用することをお勧めします。 3.1.2.1.2 非脱灰硬組織切片を使用して、まず移植前の総断面積と等しくなるように移植領域を選択し、次にこの領域で評価する必要がある残存材料または新生骨を選択します。 組織を採取し、最終的にインプラントの残存量と新骨形成量を定量的に分析し、インプラントの劣化率と新骨形成率を算出します。 注: 注入領域には、注入領域全体を完全にカバーできる単一の顕微鏡視野が適用されます。 3.1.2.1.3  式 (1) に従ってインプラント劣化率 (DR) を計算します: DR(%)=(1-RMV/IMV)×100%………………(1) ここで : DR ——インプラントの分解率、RMV——インプラントの残存量、IMV——インプラントの初期量。 3.1.2.1.4 式(2)に従って新骨形成率(RNBF)を計算します: RNBF(%)=NBFV/IMV×100%………………(2) ここで: RNBF————New骨形成速度、NBFV - 新しい骨形成量、IMV - 初期インプラント量。 3.1.2.2  平均インプラント劣化率は式 (3) に従って計算されます: P1=SDR/10……………………(3) ここで: P1————インプラントの平均劣化率。 SDR————各注入点におけるインプラントの劣化速度の合計。 3.1.2.3 平均新骨形成率は式 (4) に従って計算されます: P2=SRNBF/10……………………(4) ここで: P2———— —平均新骨形成率; SRNBF - 各インプラント部位での新しい骨形成速度の合計。 3.2 局所的な組織学的反応 3.2.1 組織学的観察（定性的） 3.2.1.1 脱灰した硬組織切片を使用して、光学顕微鏡下で試験サンプルと参照サンプルの周囲の組織反応を観察および比較します。 少なくとも観察する必要がある指標には、a) インプラント周囲の空隙の形成、b) 肉芽組織、線維症、線維嚢胞腔の形成、c) 炎症反応の程度: 1)  炎症性鬱血; 2)  炎症性細胞浸潤の数、分布および種類。 注: 炎症細胞には、好中球、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、多核巨細胞が含まれます。 d) 組織変性および壊死の存在、範囲および程度; e) 血管分布、脂肪浸潤および新骨形成。 3.2.1.2 非脱灰硬組織切片を使用し、光学顕微鏡で観察される指標には、a) 材料の破断および/または破片の存在、材料分解残留物の形状と位置、b) 材料分解残留物、b) が含まれるべきである。 ; インプラントと周囲の組織との間の界面; c) 材料を囲む組織内の空隙の形成。 3.2.2 組織学的反応の半定量的等級付けは、GB/T 16886.6-2015 の付録 E の組織学的反応採点システムに基づくものとし、試験サンプルの組織切片は個別に採点するものとします。 3.3  画像解析 必要に応じて、サポート ソフトウェアを使用して残りの金属体積を解析し、金属インプラントの体積と時間の曲線を描きます。 骨欠損面積（V0）に対する新生骨量（V1）の割合（△V）を計算します。 計算式は、△V=V1/V0×100%………………………………です。 (5) 式中、 △V——骨欠損面積に対する新生骨の体積の割合、V1——新生骨の体積、V0——骨欠損の体積。 注1：骨欠損体積（V0）とは、一般に骨欠損修復または骨欠損形成前の体積を指し、欠損の大きさに基づいて計算することも、ブランクコントロールを参照して計算することもできます。 注 2: 新骨体積 (V1) は、骨欠損領域のグレー値が一定の範囲内にある部分を指し、新しい骨グレー値の範囲はユーザー自身で定義する必要があります。 機器の違い、撮影パラメータの違い、撮影サンプルや移植部位のサイズの違い、インプラント材料のX線不透過性の値の違い、新骨の灰の値の違いなどにより、新骨の体積を計算する際には、残存材料の干渉を最小限に抑える必要があります。 4  テスト レポート テスト レポートには、結果を独立して評価できるように詳細なデータが含まれている必要があります。 試験報告書には、試験機関と試験日を記載し、次の項目を報告する必要があります: a)  使用した洗浄、取り扱い、滅菌技術 (存在する場合) を含む処理手順。 注: サンプルがこの研究室で調製されていない場合、製造業者はテストを開始する前にこの情報を提供する必要があります。 b) 動物およびインプラント 1) 動物の種、系統、供給源、年齢、性別および体重、試験期間中の環境条件、動物の食事および動物の状態、および試験期間中のすべての観察結果。 事故死の発見; 2) 動物ごとおよび部位ごとの埋め込み方法と埋め込み数。 c) サンプリングおよび組織学的準備: 1) 使用したサンプリング方法、各動物および各観察期間から採取したインプラントの数を記録する; 注: すべてのサンプルを試験の一部として含める必要があります。 3) 移植部位の一般的な観察と使用される組織学的切片作成技術。 d)  裸および顕微鏡による観察: 1) 各インプラントの観察およびインプラント周囲の組織の一般的な外観; 2)  脱灰組織切片の詳細な説明と比較評価 組織学的反応および反応グレーディング; 3)  インプラント分解率の全体平均値と標準偏差、新骨形成率の全体平均値と標準偏差、試験サンプルと参照サンプルの実験結果をそれぞれ報告します(ある場合）分解と骨形成の統計分析により、グループとコントロール、および新しい骨の成熟度の典型的な病理学的画像が得られます。 e) 結果の評価: 報告書には、分解性マグネシウムベースの金属骨インプラント部位の分解速度、新骨形成速度、および局所組織学的反応の全体的な評価が含まれるべきです。

T/CSBM 0022-2022 発売履歴

• 2022 T/CSBM 0022-2022 分解性マグネシウムベースの金属骨インプラント部位における分解、骨形成および組織反応の評価方法